Miten perustaaOmakotitalo Patch - Clamp Experiment

patch - clamp kokeilu käytetään mittaamaan yhden elävien solujen . Se tekee tämän kanssaerittäin hieno pipetin pidetään tiiviisti vastenyksittäisen solun kalvo (ulompi suojaverhoilu ) . Avaamisella pipetin on vain noin 1 mikrometrin ( tuhannesosamillimetrin ) ja ohjataan optisesti mikroskoopilla . Soluja pidetään yhtenäinenantennin käyttämälläsolun detacher , kuten trypsiiniä . Tiettyyn soluun on valittu ja pipetin kärki on solukalvon . Sulun muodostetaan käyttämällä imu-ja osa -kalvo vedetäänpipette.Things tarvitset
Cell levy
Fosfaattipuskuroitu suolaliuos tai PBS: llä (ilman kalsium ja magnesium)
Trypsiini
yrityshautomo
10 millilitran pipetillä
HEK ( ihmisen ihoon keratinocyctes ) M-koko vasikan sikiön seerumia ( FCS ) finnish Sentrifugi
External rekisteröintiliuos
Patch clamp siru
Twist korkki
Elektrodi
Näytä enemmän Ohjeet

1

Hankilevy soluja . Levy pestään kaksi kertaa 10 ml: lla PBS: ää (fosfaattipuskuroitu suolaliuos ) ilman kalsiumia ja magnesiumia. Lisätään 2 ml detacher ( trypsiiniä ) . Levyä inkuboidaan kolmen minuutin ajan 37 Celsius-astetta . Levyä tarkastellaanmikroskoopilla sen varmistamiseksi , että solut ovat irrallaan . Varovasti siirtää levyn irrottaa kaikki solutlevyn pohjasta . Lisätään 10 ml HEK ( Ihmisen ihoon keratinocyctes ) ja FCS ( sikiön lehmän seerumin ) medium . Käytä10 millilitran pipetillä siirtääsolut ylös ja alas .
2

Noudatasoluja mikroskoopilla varmistaa, että ne ovat yksittäisiä soluja . Pipetin avulla10 ml: n pipetillä , kunnes solut ovat yhden, jos tarvitaan. Sentrifugoi solut kaksi minuuttia nopeudella 1000 kierrosta minuutissa . Poistetaan kelluva . Aseta solut 10 ml naudan sikiön seerumia. Sentrifugoidaansolujen uudelleen uunissa kaksi minuuttia 1000 kierrosta minuutissa . Poistetaan kelluva . Asetasolut 200 mikrolitralla ulkoisen tallennusratkaisu . Tarkkaillasolut mikroskoopilla yksittäisiä soluja ja sileä kalvo .
3

Aseta suolaliuosta sisälläpatch clamp- siru . Lisäätippa solunsisäisen elektrolyyttiliuoksen alaosaan siru pipetillä . Asennasirun päällekierre korkki . Korkki, pitäisi sisältääviittaus elektrodin ja imuputki . Lisäätippa solunulkoisen elektrolyyttiliuoksen alkuun sirun pipetillä . Elektrolyyttiliuos mahdollistaasirun yhteyttäelektrodin . Lisää 5 ui solususpensiotasuolaliuosta sirulle . Asetayhden solun käyttämällä imua kauttapipetillä . Imu voidaan suorittaa manuaalisesti imemällä ilmaapipetillä. Paikannus solu kasvaa vastuksen tiivisteen muodostamiseksi . Tiiviste sallii tutkinnankoko solun .